Кісткові трансплантати можна отримувати з перепрограмованих людських клітин

11.01.2014

Американські дослідники вперше пройшли весь шлях по перетворенню спеціалізованих клітин людини (фібробластів шкіри і клітин кісткового мозку) в клітини кісткової тканини. Щоб змінити спеціалізацію клітин, їх спочатку перетворили в індуковані плюрипотентні клітини – клітини, які потенційно можуть придбати різні спеціалізації.
З індукованих плюрипотентних клітин були отримані клітини кісткової тканини, які вирощувались в спеціальному біореакторі, щоб отримати штучні кісточки. Вирощені кісточки володіли властивостями природних кісток людини — мали подібну щільність клітин, містили необхідні білки, виділяли необхідні позаклітинні речовини. Через 12 тижнів після імплантації мишам, отримані кістки зберігали свої властивості.

Рис. 1. Процесс получения фрагмента нижнечелюстной кости из мезенхимальных клеток костного мозга пациента.

Мал. 1. Процес отримання фрагменту нижньощелепної кістки з мезенхімальних клітин кісткового мозку пацієнта. А, В – показаний фрагмент, копію якого потрібно отримати. С – отримана з кістки теляти основа для вирощування кістки. D – вид необхідного фрагмента в різних проекціях, Е – схема біореактора, F – камера біореактора, в яку поміщається основа для вирощування кістки. В отвори подається живильне середовище, що стимулює перетворення мезенхімних клітин в клітини кісткової тканини. Ілюстрація з роботи Warren L. Grayson et al., 2010. Engineering anatomically shaped human bone grafts

Саме тому виникла мрія про створення необхідних органів з власних клітин, мінімально травмуючи при цьому самого пацієнта. Такі органи, так само як і аутотрансплантат, не викликатимуть імунного відторгнення і матимуть всі властивості природних органів. Роботи в цьому напрямку вже ведуться: так, в 2010 році була опублікована стаття (див .: Grayson et al., 2010. Engineering anatomically shaped human bone grafts), авторам якої вдалося виростити фрагмент нижньощелепної кістки з мультипотентних мезенхімальних стромальних клітин пацієнта, виділених з кісткового мозку (мал. 1). Мезенхімальні стромальні клітини – це клітини-попередники, що здатні розвиватися в клітини кісткової тканини, клітини хряща і жирові клітини. Для отримання кістки потрібно лише запустити процес перетворення цих клітин в клітини кісткової тканини і виростити їх на спеціальній основі анатомічної форми. Для заміни пошкоджених органів і тканин пацієнта — трансплантації — зараз використовуються донорські органи, штучні трансплантати, а також метод аутологічної трансплантації (пересадка пацієнтові його власних тканин). У всіх цих методів є очевидні недоліки: донорські органи можуть атакуватися імунною системою організму, штучні трансплантати не по всіх параметрах схожі з природними органами, а аутологічна трансплантація не застосовується в разі, якщо у пацієнта є патології тканин, необхідних для пересадки, і до того ж не завжди зручна через пошкодження ділянок тіла, з яких беруться клітини.

На жаль, виділення мезенхімальних клітин – це досить трудомісткий процес, і тому наступним кроком повинно було стати отримання кісток з тих клітин, які легше добути. Однак такі клітини не є природними попередниками клітин кісткової тканини, тому для отримання штучної кістки виділені клітини необхідно «перепрограмувати».

Теоретично, в цьому немає нічого неможливого, адже кожна клітина нашого організму несе всю інформацію, необхідну для функціонування будь-яких типів клітин. Однак, в спеціалізованих клітинах велика частина цієї інформації не використовується: так, існують гени, робота яких робить нервову клітину нервовою клітиною, але всі ці гени мовчать в клітинах печінки, в клітинах сітківки, в клітинах серцевого м’яза і у всіх інших клітинах з іншою спеціалізацією. Щоб змінити спеціалізацію клітини, потрібно спочатку «відключити» її поточну спеціалізацію – перевести її з диференційованого (спеціалізованого) стану в плюрипотентний (від лат. Pluralis – множинний, potentia – сила, міць, можливість, в широкому сенсі можна перевести як «можливість розвитку за різними сценаріями»). Робиться це за допомогою введення в диференційовану клітину молекул ДНК, що кодують чотири чинника плюріпотентності – виявилося, що всього лише чотирьох чинників досить, щоб відключити поточну спеціалізацію клітини і перевести її в стан, з якого вона може перетворитися в клітку іншого типу. Отримані таким чином клітини називаються індукованими плюрипотентними клітинами. З індукованих плюрипотентних клітин (Induced pluripotent stem cell, iPS cells, iPSCs) за допомогою додавання спеціальних факторів можна отримати клітини необхідного типу.

Авторам недавно опублікованій в журналі PNAS роботи вдалося здійснити всю цю послідовність дій і отримати «штучну» кістку. В якості вихідних клітин вони використовували фібробласти шкіри і клітини кісткового мозку, перетворювали ці клітини в плюрипотентні, потім переводили їх в мезенхімальні клітини,  які здатні бути попередниками клітин кісткової тканини, клітин хряща і жирових клітин. З мезенхімальних клітин за допомогою додавання спеціального середовища отримували клітини кісткової тканини. Щоб утворилася кістка необхідної форми і структури, клітини потрібно вирощувати на спеціальній основі, що представляє із себе фрагмент кістки теляти, який повністю очищений від клітин.

Для утворення кісткової тканини, схожої з природною, на основу з кістки теляти наносять невелику кількість мезенхімальних клітин. Після цього майбутня кістка протягом п’яти тижнів знаходиться в спеціальному біореакторі, де підростаючі клітини регулярно промиваються живильним середовищем. Середовище повинне також містити фактори, що сприяють перетворенню мезенхімальних клітин в клітини кісткової тканини. Характеристики потоку середовища впливають на властивості отриманої кістки, і, змінюючи потік живильного середовища через різні частини утворюється кістки, з яких можна отримати, наприклад, різну щільність клітин в різних її частинах. Детальне вивчення впливу властивостей потоку середовища на ріст клітин важливо при вирощуванні кісток анатомічної форми.

Виявилося, що штучно отримані мезенхімальні клітини людини можуть успішно заселяти таку основу і при вирощуванні у відповідному середовищі можуть перетворитися в клітини кісткової тканини. Спеціалізовані клітини кісткової тканини, що утворилися, будуть виділяти необхідні позаклітинні компоненти, завершуючи формування штучної кістки.

Для перевірки незмінних властивостей отриманих кісточок, їх імплантували під шкіру мишам, витягували через 12 тижнів і перевіряли, чи залишилися властивості кісточок колишніми. Оскільки кістки були вирощені з використанням людських клітин, а експерименти з імплантацією проводили на мишах, то щоб пересаджена кістка не була атакована імунною системою, в експериментах використовували лінію імунодефіцитних мишей. Виявилося, що в живому організмі штучно вирощені кісточки залишаються стабільними – тобто клітини залишаються життєздатними, і в них працюють ті ж гени, що до імплантації. Цікаво, що за 12 тижнів кістка починала сприйматися організмом як своя: в неї проростали судини і в ній виявляли господарські клітини-остеокласти, що займаються розбудовою кісткової тканини. Навколо кісток утворювалися капсули з пухкої сполучної тканини (мал. 2).

Микрофотографии косточек после двенадцати недель имплантации

Мал. 2. Мікрофотографії кісточок після дванадцяти тижнів імплантації. Стрілки вказують на судини, зірочками відзначають остеокласти (клітини кісткової тканини). Фотографії з додаткових матеріалів до обговорюваної статті в PNAS.

За час імплантації також підвищувалася мінералізація імплантованих кісточок (мал. 3).

3D-модели искусственно созданных косточек, полученные методом компьютерной томографии.

Мал. 3. 3D-моделі штучно створених кісточок, отримані методом комп’ютерної томографії. Зверху відзначені назви клітинних ліній, з яких отримували індуковані плюрипотентні клітини. У верхньому ряду показані кісточки до імплантації, в нижньому – після дванадцяти тижнів імплантації. Видно, що за час імплантації речовина кістки стала більш щільною, тобто утворення кісткової тканини тривало і після імплантації. Малюнок з обговорюваної статті в PNAS

Автори також вивчили, які клітини краще брати за основу, щоб вирощувати штучні кістки. В роботі порівнювалися властивості кісток, отриманих з клітин кісткового мозку, а також з шкірних фібробластів. Крім того, при отриманні плюрипотентних клітин використовували різні способи доставки фрагментів ДНК, які кодують фактори плюріпотентності, – різні векторні молекули.

Для доставлення чужорідної ДНК в клітину часто використовують молекули вірусної ДНК, в якої вилучені всі гени, що відповідають за розмноження вірусу і замість них вставлений будь-який інший ген. Такий вірус (вірусний вектор) неінфекційний, зате здатний вносити всередину клітини новий ген, що входить до складу вірусної ДНК.

Сам набір факторів також відрізнявся в різних експериментах. Виявилося, що отримані різними способами індуковані плюрипотентні клітини дають в результаті кісткову тканину з різними властивостями – у отриманих клітин трохи розрізнялися активності генів, важливих для роботи клітин кісткової тканини, відрізнялися кількості відкладеного кальцію і швидкості росту клітин в біореакторі. Кращими показниками мали клітини кісткової тканини, отримані з фібробластів при введенні факторів плюріпотентності OCT4, SOX2, KLF4 і C-MYC за допомогою вектора на основі вірусу Сендай (див. Sendai virus).

На жаль, поки не зовсім зрозуміло, які ж типи клітин найбільше підійдуть для вирощування кісток реальних пацієнтів: поки що усі досліди проводилися тільки на мишах і на модельних культурах клітин людини, не кажучи вже про те, що для підбору оптимальних клітин потрібні серйозні порівняльні дослідження . Крім того, невідомі механізми, завдяки яким клітини різного типу по-різному перепрограмовуються в кісткові клітки. Схожа ситуація з факторами плюріпотентності і з векторними молекулами – вчені поки лише підбирають їх оптимальні комбінації, але говорити про те, чому саме така комбінація хороша, і які механізми її впливу на майбутнє клітини поки складно.

Тим не менш, в роботі зроблено важливий крок на шляху до отримання необхідних пацієнту органів з його власних клітин, які легко виділити. Тепер ясно, що принаймні для кісток така технологія цілком придатна. Поки важко сказати, чи вдасться таким методом отримати інші органи – наприклад, які мають складну іннервацію або структуру кровоносних судин. Нервові клітини і клітини ендотелію судин розвиваються особливим шляхом, і для їх вирощування потрібно буде додавати різні типи клітин-попередників. При цьому потрібно буде якимось способом змусити їх зформувати правильну структуру всередині зростаючого органу. Однак, видається, що ці завдання хоча й складні, але можна вирішити, і що у нас є всі підстави вірити в швидкий розвиток медицини нового типу.

Джерела: Юлия Кондратенко elementy.ru/news/432042Giuseppe Maria de Peppo, Iván Marcos-Campos, David John Kahler, Dana Alsalman, Linshan Shang, Gordana Vunjak-Novakovic, and Darja Marolt. Engineering bone tissue substitutes from human induced pluripotent stem cells // PNAS. 2013. V. 10. P. 8680–8685.

Leave a Comment